液相色譜儀原理
【儀器原理】液相色譜法是在經(jīng)典色譜法的基礎(chǔ)上，引用了氣相色譜的理論，在技術(shù)上，流動(dòng)相改為高壓輸送（zui高輸送壓力可達(dá)4.9′107Pa）；色譜柱是以特殊的方法用小粒徑的填料填充而成，從而使柱效大大高于經(jīng)典液相色譜（每米塔板數(shù)可達(dá)幾萬(wàn)或幾十萬(wàn)）；同時(shí)柱后連有高靈敏度的檢測(cè)器，可對(duì)流出物進(jìn)行
連續(xù)檢測(cè)。
【液相色譜儀特點(diǎn)】1．高壓：液相色譜法以液體為流動(dòng)相（稱為載液），液體流經(jīng)色譜柱，受到阻力較大，為了迅速地通過(guò)色譜柱，必須對(duì)載液施加高壓。一般可達(dá)150～350*105Pa 。
2．高速：流動(dòng)相在柱內(nèi)的流速較經(jīng)典色譜快得多，一般可達(dá)1～10ml/min。液相色譜法所需的分析時(shí)間較之經(jīng)典液相色譜法少得多，一般少于1h 。
3．：近年來(lái)研究出許多新型固定相，使分離效率大大提高。
4．高靈敏度：液相色譜已廣泛采用高靈敏度的檢測(cè)器，進(jìn)一步提高了分析的靈敏度。如熒光檢測(cè)器靈敏度可達(dá)10-11g。另外，用樣量小，一般幾個(gè)微升。
5．適應(yīng)范圍寬：氣相色譜法與液相色譜法的比較：氣相色譜法雖具有分離能力好，靈敏度高，分析速度快，操作方便等優(yōu)點(diǎn)，但是受技術(shù)條件的限制，沸點(diǎn)太高的物質(zhì)或熱穩(wěn)定性差的物質(zhì)都難于應(yīng)用氣相色譜法進(jìn)行分析。而液相色譜法只要求試樣能制成溶液，而不需要汽化，因此不受試樣揮發(fā)性的限制。對(duì)于高沸點(diǎn)、熱穩(wěn)定性差、相對(duì)分子量大（大于400 以上）的有機(jī)物（這些物質(zhì)幾乎占有機(jī)物總數(shù)的 75% ～ 80%）原則上都可應(yīng)用液相色譜法來(lái)進(jìn)行分離、分析。據(jù)統(tǒng)計(jì)，在已知化合物中，能用氣相色譜分析的約占20%，而能用液相色譜分析的約占70% ～80% 。
【液相色譜儀各個(gè)系統(tǒng)的組成和特點(diǎn)是什么？】
液相色譜儀主要有進(jìn)樣系統(tǒng)、輸液系統(tǒng)、分離系統(tǒng)、檢測(cè)系統(tǒng)和數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)，下面將分別敘述其各自的組成與特點(diǎn)。
1．進(jìn)樣系統(tǒng)
一般采用隔膜注射進(jìn)樣器或高壓進(jìn)樣間完成進(jìn)樣操作，進(jìn)樣量是恒定的。這對(duì)提高分析樣品的重復(fù)性是有益的。
2．輸液系統(tǒng)
該系統(tǒng)包括高壓泵、流動(dòng)相貯存器和梯度儀三部分。高壓泵的一般壓強(qiáng)為l.47～4.4×107Pa，流速可調(diào)且
穩(wěn)定，當(dāng)高壓流動(dòng)相通過(guò)層析柱時(shí)，可降低樣品在柱中的擴(kuò)散效應(yīng)，可加快其在柱中的移動(dòng)速度，這對(duì)提高分辨率、回收樣品、保持樣品的生物活性等都是有利的。流動(dòng)相貯存器和梯度儀可使流動(dòng)相隨固定相和樣品的性質(zhì)而改變，包括改變洗脫液的極性、離子強(qiáng)度、pH 值，或改用競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑或變性劑等。這就可使各種物質(zhì)（即使僅有一個(gè)基團(tuán)的差別或是同分異構(gòu)體）都能獲得有效分離。
3．分離系統(tǒng)
該系統(tǒng)包括色譜柱、連接管和恒溫器等。色譜柱一般長(zhǎng)度為10～50cm（需要兩根連用時(shí)，可在二者之間加一連接管），內(nèi)徑為2 ～5mm ，由不銹鋼、厚壁玻璃管或鈦合金等材料制成，柱內(nèi)裝有直徑為5～10μm粒度的固定相（由基質(zhì)和固定液構(gòu)成）。固定相中的基質(zhì)是由機(jī)械強(qiáng)度高的樹脂或硅膠構(gòu)成，它們都有惰性、多孔性和比表面積大的特點(diǎn)，加之其表面經(jīng)過(guò)機(jī)械涂漬（與氣相色譜中固定相的制備一樣），或者用化學(xué)法偶聯(lián)各種基因（如磷酸基、季胺基、羥甲基、苯基、氨基或各種長(zhǎng)度碳鏈的烷基等）或配體的有機(jī)化合物。
因此，這類固定相對(duì)結(jié)構(gòu)不同的物質(zhì)有良好的選擇性。例如，在多孔性硅膠表面偶聯(lián)豌豆凝集素（PSA）后，就可以把成纖維細(xì)胞中的一種糖蛋白分離出來(lái)。
另外，固定相基質(zhì)粒小，柱床極易達(dá)到均勻、致密狀態(tài)，極易降低渦流擴(kuò)散效應(yīng)?；|(zhì)粒度小，微孔淺，樣品在微孔區(qū)內(nèi)傳質(zhì)短。這些對(duì)縮小譜帶寬度、提高分辨率是有益的。根據(jù)柱效理論分析，基質(zhì)粒度越小，塔板理論數(shù)N 就越大，這也進(jìn)一步證明了基質(zhì)粒度小，會(huì)提高分辨率的道理。
此外，液相色譜的恒溫器可使溫度從室溫調(diào)到60℃，通過(guò)改善傳質(zhì)速度，縮短分析時(shí)間，就可增加層析柱的效率。
4．檢測(cè)系統(tǒng)
液相色譜常用的檢測(cè)器有紫外檢測(cè)器、示差折光檢測(cè)器和熒光檢測(cè)器三種。
（1）紫外檢測(cè)器
該檢測(cè)器適用于對(duì)紫外光（或可見光）有吸收性能樣品的檢測(cè)。其特點(diǎn)是，使用面廣（如蛋白質(zhì)、核酸、氨基酸、核苷酸、多肽、激素等均可使用）、靈敏度高（檢測(cè)下限為10-10g/ml）、線性范圍寬、對(duì)溫度和流速變化不敏感、可檢測(cè)梯度溶液洗脫的樣品。
（2）示差折光檢測(cè)器
凡具有與流動(dòng)相折光率不同的樣品組分，均可使用示差折光檢測(cè)器檢測(cè)。目前，糖類化合物的檢測(cè)大多使用此檢測(cè)系統(tǒng)。這一系統(tǒng)通用性強(qiáng)、操作簡(jiǎn)單，但靈敏度低（檢測(cè)下限為10-7g/ml），流動(dòng)相的變化會(huì)引起折光率的變化，因此，它既不適用于痕量分析，也不適用于梯度洗脫樣品的檢測(cè)。
（3）熒光檢測(cè)器
凡具有熒光的物質(zhì)，在一定條件下，其發(fā)射光的熒光強(qiáng)度與物質(zhì)的濃度成正比。因此，這一檢測(cè)器只適用于具有熒光的有機(jī)化合物（如多環(huán)芳烴、氨基酸、胺類、維生素和某些蛋白質(zhì)等）的測(cè)定，其靈敏度很高（檢測(cè)下限為10-12～10-14g/ml），痕量分析和梯度洗脫樣品的檢測(cè)均可采用。
（5）數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)
該系統(tǒng)可對(duì)測(cè)試數(shù)據(jù)進(jìn)行采集、貯存、顯示、打印和處理等操作，使樣品的分離、制備或鑒定工作能正確開展。
上述介紹的內(nèi)容是通用儀器的原理，各液相色譜儀的具體操作要求，需使用者仔細(xì)閱讀儀器說(shuō)明書。